SPEKTROFLUOROMETRI

Spektrofluorometri mengukur intensitas emisi dari larutan yang dapat diperkuat langsung.  Spektra ini lebih spesifik karena adanya spektra emisi (fluoresensi) disamping spektra eksitasi (yang dapat disamakan dengan spektra absorpsi pada spektrofotometri). Radiasi eksitasi maupun radiasi fluoresensi, umumnya diukur pada rentang λmax 200-700nm. Pengukuran harus menggunakan pelarut yang dapat melewatkan seluruh radiasi eksitasi.

Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik atau molekul yang mengandung elektron p terkonyugasi dan/atau atom yang mengandung elektron n yang mempunyai derajat stabilitas resonansi tinggi, menyebabkan elektron valensi tereksitasi ke tingkat vibrasi tinggi dari tingkat tereksitasi elektron tingkat pertama. Transisi elektron dari tingkat tereksitasi elektron singlet pertama ke tingkat dasar, disertai pembebasan energi radiasi dengan panjang gelombang yang lebih panjang daripada panjang gelombang yang diabsorpsi. Intensitas fluoresensi sebanding dengan banyaknya molekul yang mengemisikan radiasi, dapat digunakan untuk analisis kuantitatif senyawa fluorofor.

Bergantung pada struktur kimia zat aktif yang akan dianalisis. Struktur kimia yang berfluoresensi ialah struktur aromatik, atau struktur yang mengandung ikatan rangkap terkonjugasi, yaitu elektron π dan n dalam dua ikatan rangkap atau lebih. Dalam molekul tersebut terdapat sejumlah elektron yang memiliki mobilitas lebih tinggi dibanding elektron lainnya.

Mobilitas elektron ini dipengaruhi oleh gugus subtituen pada molekul tersebut. Gugus subtituen yang memberikan kebebasan kepada elektron π adalah gugus pengarah orto- dan para-, seperti –NH₂, -OH, -F, -OCH₃, -NHCH₃, -N(CH₃)₂, serta –CN (meskipun –CN pengarah meta-). Sedangkan, pada sistem heterosiklik dipengaruhi oleh atom hetero, seperti atom O, N, S. Gugus yang mengurangi fluoresensi adalah gugus pengarah meta-, seperti –Cl, -Br, -I, -NHCOCH₃, dan –COOH.

Senyawa kimia ada yang berfluoresesnsi secara alami, tetapi pada yang tidak berfluoresensi atau intensitas fluoresensinya lemah dapat dibangkitkan fluoresensinya dengan suatu reaksi kimia untuk mengubah strukturnya atau menyambungkan molekul tersebut dengan molekul lain yang berfluoresensi kuat.

Intensitas fluoresensi suatu senyawa tergantung pada efisiensi fluoresensi, yang dipengaruhi oleh berbagai faktor diantaranya struktur molekul dengan gugus fungsi yang menunjang dan lingkungannya, pelarut dan zat terlarut didalamnya.

Kegunaan

• Analisis kualitatif    :  panjang gelombang eksitasi dan fluoresensi dalam pelarut dan pH tertentu
• Analisis kuantitatif :  untuk suatu fluorofor, F = f C (pada konsentrasi kecil), diperlukan larutan standar acuan, memungkinkan analisis dengan penambahan standar (standard addition method) untuk menghindarkan gangguan dari matriks. Untuk penentuan kadar, kepekaan metode fluoresensi lebih tinggi dari spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak.
• Di bidang kimia polimer ; untuk mendeteksi dan mengidentifikasi komponen lastik
• Bahan fluoresen dapat larut dalam larutan maupun bahan padat, misal : bahan dasar plastik, yang dapat dideteksi oleh radioaktif.
• Uji kemurnian, misal : oksidasi kemurnian pada proetilen dan polipropilen.
• Di bidang biologi ; uji struktur tersier protein dalam bentuk 3 dimensi

Penentuan Kadar

Penentuan kuantitatif dilakukan dengan membandingkan intensitas fluoresensi zat dalam larutan sampel terhadap intensitas fluoresensi zat dalam larutan baku. Pada konsentrasi fluofor yang rendah, intensitas fluoresensi sebanding dengan konsentrasi fluofor. Untuk perhitungan digunakan fluoresensi larutan sampel dibandingkan dengan fluoresensi larutan baku. Setelah keduanya dikoreksi terhadap Fluoresensi Latar Belakang (FLB), konsentrasi larutan sampel dihitung dengan rumus:

Pada penentuan kadar yang tidak langsung, dimana penurunan fluoresensi sebanding dengan naiknya konsentrasi zat yang memadamkan fluoresensi, maka intensitas fluoresensi digantikan dengan –log[Intensitas fluoresensi].